疟疾寄生虫微调突变以抵抗药物
2019-11-28   阅读:499   来源:Nature

每年约有一百万人被疟疾杀死1,其中大多数是非洲儿童。疟疾的管理,特别是由高毒力的原生动物寄生虫恶性疟原虫引起的疟疾,受到抗疟药耐药性的挑战2。Kim等人在《自然》杂志上发表的文章3报道了一种有助于抵抗的关键蛋白质,即恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白(PfCRT)的结构和分子特性。该结构揭示了排列在PfCRT关键中心腔中的氨基酸残基的微调突变的后果。这些突变的残基使抗药性寄生虫能够将某些抗疟疾药物从其作用部位转移走,而突变的影响对于密切相关的药物而言是不同的。

疟疾寄生虫在人类红细胞中度过了生命周期的一部分。在那儿,他们使用一个称为消化液的专门结合膜的隔室来降解蛋白质血红蛋白,从而生成用于生长的氨基酸构件4。血红蛋白消化还会产生一种有毒的副产物,称为血红素,被喹啉类药物(包括氯喹和哌喹)的抗疟药所利用。这些药物与消化液中释放的血红素结合,并通过寄生虫阻止化合物的解毒作用-实际上,寄生虫会通过自身的代谢碎片中毒4。

直到1980年代出现广泛的耐药性之前,氯喹的价格,安全性和功效使其成为抗击疟疾的首选药物。哌喹是一种结构相关的化合物,保留了抗氯喹寄生虫的活性,目前与另一种抗疟药双氢青蒿素联用。不幸的是,对哌喹的抗药性现在在东南亚部分地区已经普遍存在5。矛盾的是,对哌喹敏感的寄生虫通常比对哌喹敏感的寄生虫对氯喹更敏感6。

耐药性的产生可能是由于药物靶标或将药物转运至靶标或从靶标转运出的生物机械中的突变。2000年的一项具有里程碑意义的报告7确定PfCRT是恶性疟原虫抗氯喹的主要介质。抗药性在世界各地发生独立,但始终与转运蛋白中的特定突变相关联-苏氨酸残基取代赖氨酸氨基酸残基(K76T突变)。K76T与其他地理上特定的PfCRT突变相结合,以介导耐药性并提高突变寄生虫的适应性6-8。

PfCRT是被称为药物/代谢物转运蛋白9的蛋白质超家族的成员,位于寄生虫消化液的膜中。相关蛋白的结构和生化研究表明,对氯喹的抗性是由于转运蛋白使氯喹从消化液中通过,从而将其从其作用位点移走而引起的。有趣的是,当携带K76T突变的寄生虫获得进一步的突变时,就会产生哌喹喹耐药性6。

由于缺乏有关突变的PfCRT结构的信息,设计新的耐药性喹啉类抗疟药的努力受到了阻碍。但是,在过去的几年中,称为“冷冻电子显微镜”10(cryo-EM)的技术取得了革命性的进展,通过对无法嵌入X射线研究的膜嵌入蛋白(例如PfCRT)进行直接成像,彻底改变了结构生物学。晶体学。Kim等。为了研究南美7G8寄生虫中PfCRT的结构,使用了单粒子冷冻EM技术来确定PfCRT的结构,这些寄生虫具有赋予高水平氯喹抗性的突变。

作者首先必须制定出一种协议,以有效地表达,纯化和重构PfCRT到膜样环境中,以维持蛋白质的天然构象。与通常使用cryo-EM研究的蛋白质相比,PfCRT相对较小(49千道尔顿),因此Kim等人。制备了与PfCRT结合的抗体片段(称为抗原结合片段或Fab),从而形成了具有足够质量和稳定性的复合物,可以进行基于冷冻EM的结构阐明。这种方法产生了具有3.2-ångström分辨率的结构。

PfCRT被发现具有十个跨膜域和负电荷的中央腔。空腔向消化液开放,但在膜的一半处关闭。Fab结合腔的直径为25Å,足够大以容纳氯喹(最大尺寸约为14)和哌喹(最大尺寸约为21)。结构表明,野生型PfCRT在腔中具有带正电的赖氨酸残基(K76)。据认为,该残留物可以排斥氯喹(具有两个正电荷)和哌喹(具有四个正电荷),从而将它们捕获在消化液中(图1a)。

图1突变影响抗疟药物通过PfCRT蛋白的转运。a,药物氯喹和哌喹靶向疟疾寄生虫中的膜结合细胞器,称为消化液泡。恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白(PfCRT)驻留在疟疾寄生虫最强毒种的消化液膜中。人们认为野生型PfCRT中带正电荷的赖氨酸氨基酸残基(K76)可以排斥带正电荷的药物,从而防止转运出液泡(箭头),这将导致耐药性。b,Kim等人3报告了PfCRT的结构,该结构包含一个称为K76T的突变。作者发现,K76T改变了PfCRT腔内衬的电荷分布。氯喹和哌喹都与突变型腔结合,但只有氯喹穿过突变腔(可能是因为它的正电荷比哌喹低),因此对氯喹具有抵抗力,但对哌喹没有抵抗力。c,PfCRT的其他突变(例如C350R突变)导致哌喹与腔的结合比b中的结合更弱。这可能会增强该药物通过PfCRT的能力,并导致哌喹的耐药性。在这种情况下,将氯喹从消化液中运出的效率不及哌啶。

有趣的是,Kim及其同事的生化实验表明,来自7G8寄生虫的PfCRT可以结合氯喹和哌喹,但只能转运氯喹。因此,具有K76T突变的寄生虫对氯喹有抗药性,但对哌喹没有抗药性(图1b)。相比之下,当作者在过去五年中在南美11和东南亚6寄生虫中发现了进一步的7G8突变时,哌喹的外排量增加了–这种作用与对哌喹的敏感性降低有关,但对氯喹的敏感性增加了(图1c)。

Kim等。利用他们的cryo-EM结构对PfCRT进行了分子建模和静电分析,以帮助解释为什么突变会对疟原虫对氯喹和哌喹的敏感性产生相反的影响。该模型表明与哌喹抗性相关的突变可以减少负电荷或改变PfCRT中央腔的构象。这样可以防止哌喹过紧地与腔结合,从而增加其从消化液中的转运。作者建议微调腔中表面电荷的分布,以使药物与PfCRT的初始结合以及随后的运输释放对于不同药物而言是不同的,从而对药物敏感性产生不同的影响。综上所述,Kim及其同事的发现表明,恶性疟原虫正在进行持续的平衡行为,产生的突变会阻止不同药物的作用,同时又能保持寄生虫的最佳适应性。

新结构的局限性在于,由于Fab在其中央腔中的结合,PfCRT被锁定在一个对消化液泡开放的构象中。将需要进一步的研究来确定药物结合如何与允许药物运输的构象重排偶联。

在实践上,了解非洲可能出现的耐药机制尤为重要,在非洲,恶性疟原虫引起的疟疾病例超过90%1。与世界其他地区相比,非洲的PfCRT突变较少,许多国家对氯喹的耐药性正在下降,并且哌喹和二氢青蒿素的组合仍然非常有效12。我们可以期待对PfCRT的进一步研究,包括可视化药物结合的和对细胞质开放的结构构象,这将进一步解释耐药性突变的影响,并可能有助于鉴定规避耐药性的药物。目前,我们可以欣赏到Kim和同事从结构,生物化学,遗传学和寄生虫学的美好结合中获得的见解,尤其是从PfCRT的第一个原子分辨结构中获得的见解-疟疾寄生虫的微调,抗性调节机。

参考:

1.WorldHealthOrganization.WorldMalariaReport2018(2018).

2.Haldar,K.,Bhattacharjee,S.&Safeukui,I.NatureRev.Microbiol.16,156–170(2018).

3.Kim,L.etal.Naturehttps://doi.org/10.1038/s41586-019-1795-x(2019).

4.Goldberg,D.E.Curr.Top.Microbiol.Immunol.295,275–291(2005).

5.vanderPluijm,R.W.etal.LancetInfect.Dis.19,952–961(2019).

6.Ross,L.S.etal.NatureCommun.9,3314(2018).

7.Fidock,D.A.etal.Mol.Cell6,861–871(2000).

8.Summers,R.L.etal.Proc.NatlAcad.Sci.USA111,E1759–1767(2014).

9.Martin,R.E.&Kirk,K.Mol.Biol.Evol.21,1938–1949(2004).

10.Nogales,E.&Scheres,S.H.Mol.Cell58,677–689(2015).

11.Pelleau,S.etal.Proc.NatlAcad.Sci.USA112,11672–11677(2015).

12.Conrad,M.D.&Rosenthal,P.J.LancetInfect.Dis.19,e338–e351(2019).

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