新抗生素靶向细菌的外膜
2019-12-11   阅读:688   来源:Nature

抗生素耐药性是一个日益严重的全球公共卫生问题1。一类称为革兰氏阴性细菌的细菌特别难以治疗,因为细胞被双膜包膜所屏蔽,而双膜包膜构成了对抗生素2的强大屏障。当抗生素不违反膜,这些细菌经常使用外排泵,除去药3,4。现在有三篇论文(《自然》第5期,第6期中的两篇,《美国国家科学院院刊》第7期中的一篇)描述了通过直接或间接靶向外膜不可或缺的蛋白质克服这些障碍的抗生素。

革兰氏阴性菌的外膜在其小叶中包含脂多糖(LPS)分子,外膜蛋白(OMPs)8跨越整个外膜。OMP被称为β-桶装配机(BAM)的蛋白质复合物折叠到膜中,其主要成分BamA是OMP本身(图1)。由于BamA暴露于细胞外空间,因此可能是细菌屏蔽中的致命弱点–接触BamA的抑制剂无需穿透细胞。确实,概念验证研究9显示,尽管采用了未知的机制,但这种方法抑制了OMP折叠并损害了膜的完整性。

图1克服双膜屏障。革兰氏阴性细菌受到内膜和外膜的保护。外膜在外层包含脂多糖(LPS)分子和完整的外膜蛋白(OMP)。这些蛋白质在细胞的细胞质中合成,并通过易位机制(深蓝色)转运至膜之间的空间。从这里开始,它们被BAM蛋白复合物捕获,插入并折叠到外膜中(红色箭头)。BamA是BAM的主要成分,可从细菌表面进入。三项研究5-7描述似乎针对巴马,防止所需细菌生存的正常OMP折叠新的抗生素。

当前的三项研究采用了不同的方法来开发针对革兰氏阴性细菌的抗生素。首先,今井等。5转向了共生于线虫蠕虫肠道中的革兰氏阴性细菌,它们可以分泌抗生素抵御竞争细菌-包括其他革兰氏阴性物种。筛选了其中22种共生体的分泌物,发现了革兰氏阴性靶向抗生素,作者将其命名为darobactin。

在体外和感染的小鼠中,达罗布汀对多种革兰氏阴性菌均表现出抗生素活性,包括对几种耐药的人类病原体,如对多粘菌素耐药的铜绿假单胞菌和对β-内酰胺耐药的肺炎克雷伯菌和大肠埃希氏菌。在其为有效抗生素的浓度下,达罗布京对人细胞无毒。

接下来,Imai等。问了达罗沙汀靶向的细菌分子是什么。该小组鉴定了三株对达罗布汀具有抗性的大肠杆菌,并表明每种菌株都具有bamA基因突变。这些突变均改变了BamA蛋白质结构同一区域中的氨基酸残基,表明darobactin的假定结合位点可从细胞外空间进入。

这组作者提供了证据,证明达罗布汀和BamA可以通过一种称为等温滴定量热法的技术直接结合,该技术可以测量与分子之间的物理相互作用相关的热变化。核磁共振(NMR)光谱实验的结果也与直接结合一致,并表明抗生素可将蛋白质稳定在潜在的无活性构象中。

研究人员接下来表明,达罗布汀在体外可抑制分离的BAM复合物执行其OMP折叠功能的能力,这与BamA直接靶向一致。但是,在该测定中,只有一种抗性BamA突变体显示出darobactin的抑制作用降低。将来可以使用测试darobactin–BamA结合是否在bamA突变体中受损的测试来确定BamA作为分子靶标。

在当前的第二项研究中,Luther等人。6专注于现有抗生素类似物murepavadin10的类似物,其目标是被称为LptD的表面暴露蛋白,该蛋白参与在外膜8中组装LPS。Murepavadin对铜绿假单胞菌10表现出强大而狭窄的抗生素活性。因此,作者筛选了具有针对其他革兰氏阴性菌的抗生素活性的murepavadin类似物。

路德和他的同事将通过该筛选鉴定出的化合物与另一种抗生素多粘菌素B的一部分化学连接,该抗生素直接与LPS结合11。完整的多粘菌素可有效破坏细菌膜并杀死细胞,但对人类有毒12。研究人员希望,仅连接多粘菌素B的LPS结合部分可以增加其murepavadin类似物的膜靶向性。实际上,他们的策略在体外和感染了肺炎克雷伯菌,铜绿假单胞菌,大肠杆菌的小鼠中均产生了几种具有有效活性的嵌合体。和其他革兰氏阴性细菌,包括耐药菌株。值得注意的是,嵌合体在小鼠中显示出低毒性。

可以预期,嵌合体会靶向LptD,但是当Luther及其同事测试相互作用的伴侣时,他们发现了BamA靶向的证据。作者分析了表现出对嵌合体抗性的肺炎克雷伯菌菌株。他们发现抗性菌株在几个基因中带有突变,包括bamA和负责LPS修饰的基因。将野生型bamA基因重新引入耐药菌株中导致对嵌合体的敏感性增加,表明BamA在抗生素的作用机理中起作用。

通过体外测定证实了嵌合体-BamA的直接结合,作者通过荧光标记了嵌合体并监测了荧光变化,表明与大分子蛋白质(如BamA)结合。像达罗布汀一样,NMR实验表明,chimaera结合可将BamA稳定在可能无活性的构象中,这与直接针对BamA的靶向作用一致。然而,当细菌直接用嵌合体处理时,其外膜和内膜都被快速渗透。这表明这些化合物可能直接作用于膜上。结果增加了嵌合体以与多粘菌素相似的方式起作用的可能性,并与BamA结合,从而增强了它们的膜靶向性。

在第三项研究中,Hart等人。7鉴定了一种化合物MRL-494,该化合物对野生型大肠杆菌和外膜完整性和外排机制有缺陷的突变体具有相似的抗生素效价,表明该抗生素可能不需要渗透细胞即可发挥其活性。。在体外,MRL-494对革兰氏阴性病原体(包括肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌)表现出中等效力。MRL-494在动物模型中的功效仍有待测试。

作者表明,用该化合物处理大肠杆菌会导致外膜中OMP含量降低,表明BamA可能是靶标。为了支持这种可能性,Hart等人。鉴定出赋予大肠杆菌抗MRL-494的bamA突变。他们表明,尽管MRL-494抑制了表达野生型bamA的大肠杆菌细胞中OMP模型的正常折叠,但对耐药细胞的影响却较小。研究人员发现,MRL-494可稳定BamA使其免受细胞中热诱导的蛋白质聚集的影响,表明两者之间存在相互作用。但是,MRL-494可以稳定电阻bamA突变程度相似。此外,MRL-494对缺乏BamA的革兰氏阳性细菌显示出相似的效力。因此,在革兰氏阴性细菌中,MRL-494可能直接抑制BamA或靶向外膜并间接影响BamA的功能。

总之,这些研究描述了对难于治疗的革兰氏阴性细菌具有活性的新型抗生素。考虑到化合物的大小和化学性质,它们很可能会作用于细胞表面,从而绕过了突破渗透屏障的需要。今井等。提供了令人信服的证据,证明BamA是darobactin的靶标,包括推定的结合位点,可以通过证实与抗性突变体的结合减少来证实。嵌合化合物似乎都结合了BamA和LPS。但是,就像MRL-494一样,将需要进一步的实验来确定其活性是否是由对BamA的直接影响引起的。

未来的研究为每种化合物鉴定特定的BamA结合位点,并研究抗生素结合削弱BamA活性的机制,将为进一步开发抗生素提供平台。此类研究可能还揭示了BAM如何介导OMP的插入和折叠,对此知之甚少。

Darobactin和MRL-494是最初的先导化合物,药物化学作用可能会产生更有效的类似物。旨在确定其在动物模型中毒性的临床前研究也将很重要。路德和他的同事们的嵌合体正处于发展的更高级阶段,因为正如作者所表明的那样,它们在动物模型中具有强大的体内活性以及良好的毒性,药代动力学和药效学。这种新发现的抗生素类的未来看起来很有希望。

#抗生素 #革兰氏阴性菌
©2020年02月29日 11:16:16
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